1. 음성 염색법(Negative Staining)이란?
일반적인 염색(양성 염색)이 관찰 대상인 시료 자체를 착색시키는 것과 달리, 음성 염색은 시료가 아닌 시료의 주변(배경)을 전자 밀도가 높은 물질로 채우는 방법입니다.
- 원리: 전자빔이 전자 밀도가 높은 염색액(배경)은 통과하지 못하고, 상대적으로 전자 밀도가 낮은 바이러스 입자는 통과하게 됩니다. 그 결과, 검은 배경 속에 바이러스가 하얗고 투명하게 부각되어 보입니다.
- 특징: 바이러스의 외부 형태, 크기, 표면 구조(Capsomer, Envelope 등)를 매우 빠르고 세밀하게 관찰할 수 있습니다.
2. 직접 음성 염색법(Direct Negative Staining)의 과정
별도의 복잡한 시료 전처리(농축이나 정제 등)를 최소화하고, 준비된 검체액을 그리드(Grid)에 직접 올려 염색하는 방식입니다.
① 준비물
- 투과전자현미경(TEM)
- 그리드(Grid): 주로 구리(Copper) 재질의 망에 얇은 카본 막(Carbon film)이 코팅된 것을 사용합니다. (친수성 처리를 위해 글로우 방전기(Glow discharger)를 사용하기도 함)
- 염색액: 인텅스텐산(PTA), 초산우라닐(Uranyl Acetate) 등 중금속 염.
- 바이러스 부유액: 배양액, 분변 추출액, 혈청 등.
② 실험 순서
- 시료 부착: 바이러스가 포함된 액체 시료 한 방울을 카본 코팅된 그리드 위에 올립니다. (약 1~2분간 대기하여 바이러스가 막에 달라붙게 함)
- 세척: 여과지(Filter paper)로 과도한 시료 액체를 흡수하여 제거합니다. (필요 시 증류수로 가볍게 세척)
- 염색: 염색액(예: 2% PTA 또는 2% Uranyl Acetate) 한 방울을 그리드 위에 올립니다. (약 30초~1분)
- 건조: 여과지로 염색액을 살짝 찍어내어 아주 얇은 막만 남긴 후, 공기 중에서 완전히 건조합니다.
- 관찰: TEM을 통해 바이러스의 형태를 관찰합니다.
3. 주요 염색제 종류
- 인텅스텐산 (Phosphotungstic Acid, PTA):
- 가장 일반적으로 사용됩니다.
- pH 조절(보통 pH 7.0)이 용이하여 바이러스 입자의 구조적 변형이 적습니다.
- 초산우라닐 (Uranyl Acetate, UA):
- 입자가 매우 미세하여 해상도가 아주 높습니다.
- 다만, 자체 pH가 낮아(산성) 일부 바이러스 구조를 손상시킬 수 있고, 방사성 물질 관리가 필요합니다.
4. 장점과 단점
장점
- 신속성: 시료 준비부터 관찰까지 10~15분 내외로 매우 빠릅니다. (응급 진단에 유리)
- 형태 보존: 시료를 고정하거나 절편으로 자르지 않으므로 바이러스의 본래 입체 구조를 보기 좋습니다.
- 범용성: 바이러스의 종류를 모르는 상태에서도 형태학적 특징만으로 군(Family) 단위의 분류가 가능합니다.
단점
- 시료 농도: 시료 내에 바이러스 농도가 높아야 합니다. (최소 $10^6$ ~ $10^9$ particles/mL 이상 필요)
- 배경 잡음: 시료에 단백질이나 불순물이 많으면 배경이 지저분해져 관찰이 어려울 수 있습니다.
5. 임상적 활용
- 원인 미상 질환의 신속 진단: 노로바이러스(분변), 로타바이러스, 폭스바이러스(수포액) 등의 감염 여부를 즉각 확인할 때 사용합니다.
- 품질 관리: 백신 개발 과정이나 바이러스 유사 입자(VLP) 제조 시 입자의 형성과 무결성을 확인하는 데 필수적입니다.
직접 음성 염색법은 현대의 분자진단(PCR)법에 비해 민감도는 낮을 수 있으나, "눈으로 직접 형태를 확인"할 수 있다는 점에서 바이러스학 연구와 진단에서 여전히 매우 중요한 위치를 차지하고 있습니다.