아닐린 블루를 이용한 캘로스 염색의 원리, 방법 및 주요 용도에 대해 정리해 드립니다.
1. 염색 원리
- 특이적 결합: 아닐린 블루 시약에 포함된 성분(주로 Sirofluor)이 캘로스의 $\beta$-1,3-글루칸 구조에 특이적으로 결합합니다.
- 형광 특성: 캘로스와 결합한 아닐린 블루는 자외선(UV light) 조사를 받으면 흥분하여 밝은 황록색(Yellow-green) 또는 하늘색 형광을 방출합니다.
- 조건: 보통 알칼리성 조건(pH 8.5~12.0)에서 형광 강도가 가장 높게 나타납니다.
2. 주요 관찰 대상 (식물 내 캘로스 분포)
식물은 발달 과정이나 스트레스 반응 시 특정 부위에 캘로스를 축적합니다. 1. 체관부(Phloem): 체관판(Sieve plates)의 구멍 주위에 캘로스가 침착되어 물질 이동을 조절합니다. 2. 화분관(Pollen tube) 생장: 화분관의 벽과 화분관 내부의 플러그(Callose plug) 형성 관찰에 필수적입니다. 3. 병해충 방어(Papillae): 식물이 병원균(곰팡이 등)의 침입을 받으면 침입 부위에 '파필라'라는 캘로스 장벽을 만들어 방어합니다. 4. 원형질연락사(Plasmodesmata): 세포 간 통로인 원형질연락사의 개폐를 조절하기 위해 입구에 캘로스가 축적됩니다. 5. 상처 반응: 물리적 상처가 났을 때 손상된 부위를 빠르게 폐쇄하기 위해 생성됩니다.
3. 일반적인 실험 프로토콜 (요약)
- 고정(Fixation): 식물 조직을 에탄올:빙초산 (3:1) 혼합액 등에 고정합니다. (조직의 엽록소를 제거하여 배경 형광을 줄이는 과정이 포함되기도 함)
- 투명화(Clearing): 필요 시 NaOH 또는 KOH 용액을 사용하여 조직을 투명하게 처리합니다.
- 염색액 준비: 0.01% ~ 0.1% 아닐린 블루를 $0.1M$ $K_3PO_4$ 또는 $K_2HPO_4$ 완충액(pH 8.5~12)에 녹입니다.
- 염색: 암소(어두운 곳)에서 30분~수 시간 동안 염색합니다.
- 현미경 관찰: 형광 현미경을 사용하며, UV 필터 세트(Excitation: ~370nm, Emission: ~509nm)를 이용해 관찰합니다.
4. 주의사항 및 팁
- 빛 차단: 아닐린 블루는 광퇴색(Photobleaching)이 일어날 수 있으므로 염색 및 보관 시 빛을 차단해야 합니다.
- 배경 형광: 식물 세포벽의 리그닌(Lignin)이나 엽록소(Chlorophyll)도 자체 형광(Autofluorescence)을 나타낼 수 있으므로, 대조군을 잘 설정하고 필요 시 클로로필을 완전히 제거해야 정확한 캘로스 관찰이 가능합니다.
- pH 조절: 형광의 세기는 pH에 민감하므로 인산칼륨(Potassium phosphate) 완충액을 사용하는 것이 권장됩니다.
5. 요약
아닐린 블루 염색법은 식물의 발달 단계 관찰(수분, 물질 수송)과 식물 병리학(방어 기작 확인) 연구에서 캘로스의 위치와 양을 시각화하는 가장 강력하고 효율적인 도구입니다.