파이토플라즈마는 세포벽이 없고 식물의 체관(Phloem)에서만 서식하는 특성이 있는데, Dienes 염색약은 이 체관 내의 파이토플라즈마를 특이적으로 염색하여 감염 여부를 확인하게 해줍니다.
구체적인 분석 원리와 과정은 다음과 같습니다.
1. Dienes 염색의 원리
파이토플라즈마는 세균과 달리 세포벽이 없는 몰리쿠트(Mollicutes) 강에 속합니다. Dienes 염색약(Methylene blue와 Azure II 혼합액)은 파이토플라즈마의 농축된 세포질에 반응하여 진한 청색(Dark blue) 또는 터키블루(Turquoise) 색상을 띱니다. 정상적인 식물 세포와는 구별되는 색을 나타내므로 현미경 상에서 감염된 체관 부위를 식별할 수 있습니다.
2. 염색약 조제 (Dienes Stain)
일반적으로 다음과 같은 비율로 혼합하여 조제합니다. Methylene Blue: 2.5g Azure II: 1.25g Maltose: 10.0g Na₂CO₃ (탄산나트륨): 0.25g 증류수: 100ml (조제 후 필터 페이퍼로 여과하여 사용)
3. 분석 절차 (과정)
- 시료 채취: 감염이 의심되는 식물의 줄기, 잎자루(엽병), 또는 뿌리를 준비합니다. (파이토플라즈마는 체관에 존재하므로 전도 조직이 발달한 부위가 좋습니다.)
- 절편 제작: 면도날 등을 사용하여 조직을 매우 얇게(가로 절단면) 자릅니다. (도립현미경이나 일반 광학현미경 관찰이 가능할 정도의 두께)
- 염색: 준비된 절편을 Dienes 염색약에 10분~20분 정도 침지시킵니다.
- 세척: 증류수나 알코올 계열로 여분의 염색약을 씻어냅니다.
- 검경: 슬라이드 글라스에 올리고 커버 글라스를 덮은 뒤 광학현미경(100x ~ 400x)으로 관찰합니다.
4. 결과 판독
- 양성 (감염): 체관부(Phloem) 조직 내에 진한 파란색(Dark blue)의 반점이나 불규칙한 덩어리가 관찰됩니다. 이는 체관 내에 파이토플라즈마가 밀집되어 있음을 의미합니다.
- 음성 (건전): 체관 조직이 염색되지 않거나, 아주 연한 하늘색으로 균일하게 보입니다. 목질부(Xylem)는 원래 푸른색 계열로 염색될 수 있으므로 체관부와 혼동하지 않도록 주의해야 합니다.
5. Dienes 염색법의 장단점
장점: 신속성: PCR 분자 진단에 비해 검사 시간이 매우 짧습니다. 저비용: 고가의 장비나 시약 없이 기본적인 현미경 시설만으로 가능합니다. 현장성: 대량의 샘플을 1차 스크리닝할 때 유리합니다.
단점: 낮은 민감도: 파이토플라즈마의 밀도가 낮을 경우 검출되지 않을 수 있습니다. 비특이적 반응: 간혹 다른 미생물이나 식물의 자체 대사 물질에 의해 위양성(False positive) 반응이 나타날 수 있습니다. 숙련도 요구: 건전 조직과 감염 조직을 구분하기 위해 식물 해부학적 구조에 대한 이해가 필요합니다.
6. 결론
Dienes 염색법은 파이토플라즈마 감염을 확인하는 1차적인 진단 도구로 매우 유용합니다. 하지만 정확한 종(Species) 판별이나 확진을 위해서는 PCR(중합효소 연쇄반응)이나 Nested PCR을 통한 유전자 분석을 병행하는 것이 일반적인 절차입니다.
최근에는 대추나무 빗자루병, 오동나무 빗자루병 등의 진단에서 현장 예비 진단용으로 주로 활용됩니다.